La Microfluidique pour la détection de pathogènes

Depuis deux ans , le Fonds ESPCI Paris finance la thèse d’Étienne COZ au laboratoire MMN (Microfluidique, MEMs et nanostructure). Le projet concerne le développement d'un système papier de diagnostic par amplification d'ADN/ARN pour la détection de pathogènes (Ebola, Zika, etc) sur le terrain et à moindre coût.

Étienne Coz nous décrit ci-dessous l’avancée de ses travaux de recherche.

Mon projet de thèse financé par le Fond ESPCI s’intéresse au développement d’un système papier de diagnostic par amplification d’ADN/ARN pour la détection de pathogènes (Ebola, Zika, etc.) sur le terrain. À l’inverse des tests immunologiques qui nécessitent d’attendre une réponse du système immunitaire, on peut ici détecter le pathogène dès la contamination et ainsi faire du diagnostic précoce. Les acides nucléiques (ADN/ARN) spécifiques des pathogènes sont ici démultipliés puis spécifiquement marqués pour permettre une détection sous illumination ultra violette. Le système doit répondre aux critères internationaux « ASSURED » proposé par l’OMS, c’est-à-dire être peu couteux, sensible et spécifique, robuste, facile d’utilisation et ne pas nécessiter d’équipements lourds. C’est donc un sujet de thèse très appliqué mené en partenariat avec la CIBU (Cellule d’Intervention Biologique d’Urgence) de l’Institut Pasteur de Paris.

Le principe est d’utiliser le papier comme une pompe capillaire passive. Lorsqu’une goutte de liquide est déposée sur un milieu poreux, typiquement un buvard, celle-ci va être absorbée. On peut, en imprimant sur le buvard des barrières de cire hydrophobes, créer des voies qui vont permettre de diriger le flux. En introduisant des réactifs sur le parcours et par un système d’origami, il est possible de créer une structure 3D pour diriger les flux dans différents canaux et de réaliser alors plusieurs réactions.

Depuis mon arrivée sur le projet, un effort a été porté sur le développement d’une puce microfluidique simple d’utilisation permettant à la fois l’extraction des acides nucléiques et leur amplification. Notre dernier prototype présenté ici se compose de plusieurs volets. Le premier avec la membrane de capture permet d’extraire l’ADN de l’échantillon liquide. Une fois celui-ci replié sur la zone de test, l’ADN est mis au contact de la zone d’amplification, l’interface de réhydratation permet de réhydrater les zones de réactions, ici au nombre de trois : test de l’échantillon, contrôles positif et négatif assurant le bon déroulement du test. La puce peut enfin être scellée et l’amplification isotherme démarrée sur une plaque chauffante à 65°C.

Une autre partie significative a été le travail sur la lyophilisation des réactifs. L’objectif final serait d’avoir l’intégralité des réactifs d’amplification lyophilisés sur la puce. Cela permettrait d’avoir un système de diagnostic tout-en-un, ne nécessitant qu’une simple réhydratation à l’eau pour être utilisé sur le terrain.

Nous utilisons un fluorophore combiné à l’une des 6 amorces utilisées pour l’amplification d’une région spécifique du génome d’un pathogène. L’amorce ne fluoresce qu’à la condition qu’elle soit utilisée dans une amplification. Ainsi, on marque spécifiquement une amplification avec un fluorophore donné. On peut donc, sur un même disque de papier, lieu de notre réaction de biologie moléculaire, combiner deux jeux d’amorces spécifiques à deux pathogènes différents. Les deux types d’amorces sont marqués d’un fluorophore de couleur différente. Dans notre système par exemple, sur un premier disque, une fluorescence verte signifiera l’amplification de zika tandis que la couleur rouge signifiera l’amplification du virus de la Dengue. Sur le deuxième disque, la couleur verte marque le bon fonctionnement du test, c’est ici notre contrôle positif. La couleur rouge marque la détection du chikungunya.

Le mix de réaction utilise une nouvelle enzyme mieux compatible avec la lyophilisation. Les performances du test sont améliorées.

J’ai finalement déplacé mon système expérimental à l’Institut Pasteur dans l’équipe de Jean-Claude Manuguerra (la CIBU). J’y poursuis le développement de notre test de diagnostic sur de véritables virus. (Nous travaillions précédemment sur de l’ARN extrait de ces virus). Les résultats sont solides sur des échantillons représentatifs de cas cliniques. (Charge virale classique de virus dans un plasma humain).

Nous allons effectuer prochainement une étude clinique sur de vraies échantillons de patients atteints par les virus Dengue, zika, chikungunya.